เมื่อได้ระบุขนาดยาหรือช่วงขนาดยาแล้ว ขั้นต่อไปก็คือการตรวจว่ายามีฤทธิ์ทางชีวภาพ (biological activity) หรือมีผลอะไรหรือไม่[2]การทดลองระยะ 2 จะทำกับคนกลุ่มใหญ่กว่า (100-300 คน) และออกแบบเพื่อประเมินว่ายาทำงานได้ดีหรือไม่ รวมทั้งประเมินความปลอดภัยที่ทำในระยะ 1 ต่อไปแต่กับอาสาสมัครหรือคนไข้กลุ่มใหญ่กว่าการตรวจยีนจะทำอย่างสามัญ โดยเฉพาะเมื่อมีหลักฐานว่าอัตราเมแทบอลิซึมของยาต่าง ๆ กัน[2]ถ้าการพัฒนายาใหม่ล้มเหลว ก็มักจะเกิดในระยะ 2 เพราะพบว่ายาไม่มีผลตามคาด หรือมีพิษ

งานศึกษาระยะ 2 บางครั้งแบ่งออกเป็นระยะ 2a และ 2b แม้จะไม่มีนิยามที่แน่นอน แต่โดยทั่วไปแล้ว

• ระยะ 2a ปกติเป็นงานศึกษานำร่องออกแบบเพื่อแสดงประสิทธิศักย์ทางคลินิกหรือฤทธิ์ทางชีวภาพ (เป็นงานศึกษาพิสูจน์แนวคิด)[upper-alpha 6][15]
• ระยะ 2b สืบหาขนาดดีสุดที่ยามีฤทธิ์ทางชีวภาพโดยมีผลข้างเคียงน้อยสุด (เป็นงานศึกษาหาขนาดแน่นอน)[upper-alpha 7][15]

งานทดลองบางงานรวมระยะ 1-2 เข้าด้วยกัน คือตรวจทั้งประสิทธิศักย์ (efficacy) และความเป็นพิษ (toxicity)

รูปแบบการทดลองการทดลองระยะ 2 บางงานออกแบบเป็น case series เพื่อแสดงความปลอดภัยและฤทธิ์ในกลุ่มคนไข้ที่จำเพาะโดยไม่มีกลุ่มควบคุม ส่วนงานอื่น ๆ ออกแบบเป็นการทดลองแบบสุ่มและมีกลุ่มควบคุม (RCT) ที่คนไข้บางส่วนรับยา/การรักษาที่เป็นประเด็นงานศึกษา และที่เหลือรับยาหลอก/การรักษามาตรฐาน การทดลองแบบสุ่มระยะ 2 จะมีคนไข้จำนวนน้อยกว่าการศึกษาแบบสุ่มระยะ 3การทดลองรักษามะเร็งในระยะแรก ผู้วิจัยจะพยายามกันยาที่ไม่มีฤทธิ์ทางชีวภาพหรือมีน้อยออก ยกตัวอย่างเช่น นักวิจัยอาจตั้งเกณฑ์ว่ายาต้องมีฤทธิ์อย่างน้อยระดับหนึ่ง เช่น ในผู้ร่วมการทดลองร้อยละ 20 ถ้ามีน้อยกว่า 20% นักวิจัยก็จะเลือกยุติพิจารณายานี้ อย่างน้อยก็ไม่ใช่ในขนาดยามากสุดที่ทนได้ ถ้ามากกว่า 20% นักวิจัยก็จะเพิ่มผู้ร่วมการทดลองเพื่อประเมินอัตราการตอบสนองให้แม่นยำกว่า งานศึกษาที่กันการรักษาที่มีอัตราตอบสนองร้อยละ 20 หรือน้อยว่าปกติจะมีผู้ร่วมการทดลอง 14 คน ถ้าผู้ร่วมการทดลอง 14 คนแรกไม่ตอบสนองต่อยาเลย การมีฤทธิ์ร้อยละ 20 หรือยิ่งกว่าก็จัดว่ามีโอกาสน้อย จำนวนผู้ร่วมทดลองที่เพิ่มจะขึ้นอยู่กับความแม่นยำที่ต้องการ แต่ปกติอยู่ระหว่าง 10-20 คน ดังนั้น งานศึกษามะเร็งระยะ 2 อาจรับสมัครอาสาสามัครน้อยกว่า 30 คนเพื่อประเมินอัตราการตอบสนอง[2]ประสิทธิศักย์เทียบกับประสิทธิผลเมื่องานศึกษาประเมินประสิทธิศักย์ (efficacy) ก็จะตรวจดูว่ายาที่ให้อาสาสมัครตามลักษณะเฉพาะที่ว่าในงานศึกษามีผลตามที่ต้องการ (เช่น ขนาดเนื้องอก) ในกลุ่มโดยเฉพาะ ๆ (เช่น คนไข้มะเร็งที่ไม่เป็นโรคอื่น ๆ) หรือไม่ เมื่องานศึกษาประเมินประสิทธิผล (effectiveness) ก็จะประเมินว่าการรักษาจะมีผลต่อโรคหรือไม่ แต่ในงานศึกษาประเมินประสิทธิผล จำเป็นต้องรักษาคนไข้เหมือนกับในสถานการณ์จริง ๆ ซึ่งหมายความว่า ไม่ควรมีปฏิบัติการไร ๆ ในงานศึกษาที่ใช้เพิ่มการทำตามแพทย์ของคนไข้นอกเหนือจากที่จะทำเมื่อรักษาคนไข้ทั่วไป ผลที่ต้องการในงานศึกษาประสิทธิผลจะทั่วไปกว่างานศึกษาประสิทธิศักย์ เช่น คนไข้รู้สึกดีขึ้นหรือไม่ มาหาแพทย์น้อยลงหรือไม่ อายุยืนขึ้นหรือไม่ เทียบกับการได้ค่าตรวจดีกว่าหรือมีจำนวนเซลล์ที่ลดลงในงานศึกษาประสิทธิศักย์ ปกติเกณฑ์รับคนไข้ในงานศึกษาประสิทธิผลจะเคร่งครัดน้อยกว่างานศึกษาประสิทธิศักย์ เพราะนักวิจัยสนใจว่ายาจะมีผลต่อคนไข้ทั่วไปเช่นไร นักวิจัยบางท่านอ้างว่า งานศึกษาระยะ 2 บางงานเล็กเกินกว่าที่ควรจะเป็น[2]

อัตราความสำเร็จ

การทดลองทางคลินิกระยะ 2 ตามประวัติมีอัตราประสบความสำเร็จต่ำสุดในบรรดาระยะพัฒนาการ 4 ระยะในปี 2010 การทดลองระยะ 2 ที่ผ่านไปทำระยะ 3 ต่ออยู่ที่อัตราร้อยละ 18[16]สำหรับการทดลองขนาดใหญ่ระหว่างปี 2006-2015 ยาแคนดิเดตที่ผ่านระยะ 2 แล้วทดลองต่อในระยะ 3 อยู่ที่อัตราร้อยละ 30.7[17]